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Publikationstyp: Dissertation
Dokumenttyp:

Jahr: 2011

AutorInnen: Kautschitsch, Susanna

Titel: Novel Approaches to Gene Targeting.

Titelvariante: Neue Gene Targeting Anwendungen

Quelle: Dissertation, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 129.


Betreut von:

Rülicke Thomas

Begutachtet von:
Müller Mathias

Einrichtung:
Institut für Labortierkunde


Abschluss Datum: 08.06.11


Abstract:
Die gezielte Modifikation des Säugergenoms ist ein integraler Bestandteil in der genetischen Grundlagenforschung. Technologien, mittels derer DNA Konstrukte in das Genom eines Organismus eingebracht werden können, wurden in den letzten Jahrzehnten entwickelt und verbessert. Immer wichtiger wurde auf diesem Gebiet die gezielte Veränderung von Genabschnitten. Mit dem sogenannten Gene Targeting ist es möglich geworden, innerhalb Embryonaler Stammzellen (ES Zellen), über den Mechanismus der Homologen Rekombination (HR) gezielt Gene zu mutieren. Diese Technologie erfordert spezifische Kenntnisse der ES Zellkultur und gestaltet sich bisweilen als sehr zeit- und kostenintensiv. Um diese aufwändigen Technologien zu optimieren oder gar zu umgehen, wurden in dieser Arbeit zwei verschiede Ansätze entwickelt. Einerseits wurde eine doppelt fluoreszente ES Zelllinie entwickelt, die potentielle Targeting Events über die Rekombination von Fluoreszenzgenen am Rosa26 Lokus, sichtbar macht. Über spezifische Zuchtschritte des Cre Reporter Stammes Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J und anschließender ES Zell Isolation, konnte eine entsprechend doppelt fluoreszente ES Zelllinie erzeugt werden. mT (mTomato) und mG (mEGFP) werden am Rosa26 Lokus an den korrespondierenden Allelen exprimiert. Bei einem Rosa26 knock-in Targeting Experiment wird eines der beiden Fluoreszenzgene über HR durch ein Targeting Konstrukt ersetzt und hiermit die entsprechende Fluoreszenzexpression unterbunden. Innerhalb zweier Targeting Experimenten, in insgesamt vier 96-well Platten, konnten sechs potentiell getargetete ES Zellklone identifiziert werden, von denen drei korrekt eingebaute Konstrukte zeigten. Diese Technologie ermöglicht es, weitaus weniger potentiell getargetete Klone molekularbiologisch zu untersuchen, als dies bei einem herkömmlichen Gene Targeting Experiment der Fall wäre. Andererseits wurde in dieser Arbeit ein transgenes Mausmodell generiert, welches das HR Schlüsselprotein Rad51 in Eizellen überexprimiert. In diesem Mausmodell wird Rad51 unter der transkriptionellen Kontrolle des murinen Zp3 Promoters in unbefruchteten Eizellen exprimiert. Dieser Promoter ist lediglich während der Oogenese aktiv. Die Überexpression von Rad51 in Oozyten soll den Mechanismus der HR stimulieren und einen gezielten Einbau von DNA Konstrukten in der Eizelle über Mikroinjektion ermöglichen. Resultierende, erfolgreich gezielt manipulierte Nachkommen aus diesen Injektionsexperimenten können die erzeugte Mutation direkt an ihre Nachkommen vererben. Somit entfallen die, bei der ES Zell Technologie erforderlichen chimären Zwischenstufen. In dieser Arbeit konnten über herkömmliche Vorkerninjektion fünf transgene Founderlinien erzeugt werden. Mittels RT-qPCR konnte in einer dieser Linien transgene Rad51 mRNA Expression in Eizellen nachgewiesen werden. In weiterer Folge sollen Gene Targeting Konstrukte mittels Mikroinjektion in Eizellen eingebracht werden und hier über HR zu einem erfolgreichen Targeting Event führen. Beide neu entwickelten Technologien haben zu Ziel, die gezielte Manipulation des Säugergenoms zu erleichtern und die Erzeugung von knock-out bzw. knock-in Modellen für die Genforschung mit geringerem Aufwand zu ermöglichen.


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