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Gewählte Publikation:

Publikationstyp: Dissertation
Dokumenttyp:

Jahr: 2010

AutorInnen: Rizwan, Muhammad

Titel: Proteome profiling of Aspergillus ochraceus by 2-D gel electrophoresis and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.

Titelvariante: Proteinanalyse von Aspergillus ochraceus mittels 2-D gelelectrophorese und MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie

Quelle: Dissertation, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 134.


Betreut von:

Razzazi-Fazeli Ebrahim

Begutachtet von:
Ehling-Schulz Monika

Einrichtung:
VetCore


Abschluss Datum: 07.10.10


Abstract:
Aspergillus ochraceus ist ein filamentöser Schimmelpilz der das toxische und krebserregende sekundäre Stoffwechselprodukt Ochratoxin A produziert. Obwohl das Genom vieler wichtiger Pilze in den letzten Jahren sequenziert wurde, gibt es noch immer wenig Information über das Proteom von Apergillen. Um einen umfassenden Überblick über die Proteine von A. ochraceus zu erlangen wurden Experimente mit 2D Gelelektrophorese und MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie durchgeführt. Die OTA-Konzentration in Flüssigkulter wurde mittels HPLC gemessen. Da die Zellwand des Pilzes außerordentlich resistent ist wurden zwei verschiedene Aufschlußprotokolle getestet: (i) Lyse durch manuelles Zerreiben mit flüssigem Stickstoff und (ii) mechanische Lyse durch schnelles Schütteln mit kleine Glaskügelchen im MagNalyser. Das Zerreiben in der Reibschale mit flüssigem Stickstoff stellte sich als effektivere Extraktionsmethode heraus. Es wurden größere Proteinkonzentration und klare Banden im SDS Gel festgestellt. In dieser Studie wurden auch die Proteom der beiden A. ochraceus Stämme NRRL 5221 und NRRL 5175 mittels DIGE verglichen. Hier wurden viele unterschiedlich regulierte Proteinspots gefunden. Bei der 2D-Elektrophorese wurde ein breites Spektrum von Proteinen in einer Vielzahl an unterschiedlichen isoelektrischen Punkten und Molekülmassen erhalten. Die Spots mit der größten Intensität wurden ausgeschnitten und für die massenspektrometrische Analyse verwendet. Es konnten 41 Spots, die für 26 Proteine stehen, identifiziert werden. Die meisten Proteine sind in metabolische Prozesse und die Stressreaktion involviert. Zwanzig Spots konnten über MS/MS Spektren und durch die Suche in Datenbanken mittels MASCOT-Datenbanksuche identifiziert werden. Proteine bei denen keine Signifikanten Ergebnisse mit MASCOT gefunden werden konnten wurden entweder manuell (FlexAnalysis) oder automatisch (PEAKS) annotiert. Die häufigsten Petidfragmente ``y-Ionen'' und ``b-Ionen'', sowie die selteneren Fragmente ``a-Ionen'' und Immonium Ionen wurden herangezogen um die de novo Sequenzierung der MS/MS Spektren zu vervollständigen. Diese wurden dann für eine Suche nach Homologien (Homology Search) verwendet. 21 Spots konnten so identifiziert werden. Eine Vielzahl der identifizierten Proteine konnte in dieser Studie zum ersten Mal A. ochraceus zugeordnet werden, wodurch in zukünftigen Arbeiten die Suche nach Faktoren, die für die Mykotoxinbildung unter unterschiedlichen Bedingungen verantwortlich sind, wesentlich erleichtert werden kann.

Schlagworte:
Proteom / Aspergillus ochraceus / MALDI-TOF TOF Massenspektrometrie / 2D Gelelektrophorese / Proteine / Ochratoxin A (OTA) / HPLC / De novo Sequenzierung / DIGE / Proteinanalyse


Im Rahmen der Hochschulschrift entstandene Publikation(en):

Rizwan, M; Miller, I; Tasneem, F; Böhm, J; Gemeiner, M; Razzazi-Fazeli, E (2010): Proteome analysis of Aspergillus ochraceus. Mycotoxin Res. 2010; 26(3):171-180

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