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Publikationstyp: Bakkalaureatsarbeit
Dokumenttyp:

Jahr: 2010

AutorInnen: Ernst, Christina

Titel: Identification und Characterization of a cystein-rich Motif in Reverse Transcriptase encoded by the Human L1 element.

Quelle: Bakkalaureatsarbeit, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 33.


Betreut von:

Klein Dieter

Begutachtet von:
Razzazi-Fazeli Ebrahim

Einrichtung:
Institut für Virologie


Zugehörige(s) Projekt(e): Virus-Wirt Interaktionen


Abstract:
Long Interspersed Nuclear Elements-1 (LINE-1) oder L1 Elemente sind aktive Mitglieder der autonomen Familie der non-LTR Retrotransposons. Sie nehmen bis zu 17% des menschlichen Genoms ein. Mobile L1 Elemente reintegrieren mit Hilfe einer selbst codierten Reversen Transkriptase (RT) über RNA-Intermediate in das Genom. Aktive L1 Elemente können Erbkrankheiten oder bösartige Transformationen verursachen. Ihre Transkripte können in menschlichen Krebszellen detektiert werden, dadurch stellen sie einen Ansatzpunkt für Krebstherapie dar. In dieser Arbeit beschäftigten wir uns mit der Charakterisierung eines Cystein-reichen Motivs (C-domain), das Teil der humanen L1 Reversen Transkriptase ist (L1 RT). Die L1 RT, eine große multifunktionelle Polymerase, spielt eine wichtige Rolle bei der Reversen Transkription und der Integration des L1 Elements ins Genom. Es ist ein 150 kDa schweres Enzym, bestehend aus einer N-terminalen AP-like Endonuklease, einer Reversen Transkriptase Domäne und einer C-terminalen Domäne mit noch unbekannter Funktion. Um die Funktion der C-domain zu klären, muss die Struktur des Proteins analysiert werden. Versuche wie kontrollierter Proteaseverdau, MALDI-TOF-MS, Protein-Sequenzierung und Alignment und Vorhersage der dreidimensionalen Struktur könnten wichtige Informationen dazu beitragen. Das Protein zeichnet sich jedoch durch starke Hydrophobizität aus, was Expression und Proteinreinigung erschwerte. Wir untersuchten Expressionslevel verschiedener Rekombinanten, die die C-domain, kombiniert mit Leader-Sequenzen unterschiedlicher Länge, enthielten. Ein Protokoll zur Proteinreinigung in zwei Schritten wurde erstellt. Wir testeten verschiedene pH-Werte und Salzkonzentrationen mit Hilfe von Gelfiltrations-, Ionenaustausch- und Affinitäts-Chromatographie. Die gereinigten Proteine wurden mittels SDS-HEPES-PAGE und Western blotting charakterisiert. Banden mit ähnlichem Molekulargewicht (28 kDa) wurden mittels MALDI-TOF-MS überprüft, um das Zielprotein sicher zu identifizieren. Die C-domain wurde 4300-fach, zu 90% Homogenität aufgereinigt. Ein theoretischer Proteaseverdau, gefolgt von einer BLAST-Suche, wurde durchgeführt, um die mögliche Anwendung des L1 ORF2p als Marker für Krebszellen zu evaluieren. Durch Vergleichen der Ergebnisse von Proteaseverdau und MS konnte ein ‚signature‘ Peptid bestimmt werden.


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