Veterinärmedizinische Universität Wien Forschungsinformationssystem VetDoc

Grafischer Link zur Startseite der Vetmeduni Vienna

Gewählte Publikation:

Open Access Logo

Publikationstyp: Bakkalaureatsarbeit
Dokumenttyp:

Jahr: 2010

AutorInnen: Haas, Jasmin

Titel: Insertion site analysis of EIAV based vectors in mouse model for hemophilia B gene therapy.

Quelle: Bakkalaureatsarbeit, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 40.


Betreut von:

Klein Dieter

Begutachtet von:
Günzburg Walter

Einrichtung:
VetCore


Abstract:
Die Untersuchung der Insertionsstellen von auf EIAV basierenden Vektoren im Mausmodell für die Hämophilie B Gentherapie war das Thema dieser Bachelorarbeit. EIAV provirale SMART2Z oder SMART hFIX Vektoren, die das β-Galactosidase-Gen und das Faktor IX-Gen beinhalten, wurden auf hFIX knock-out Mäuse übertragen, um im Mausgenom eine stabile und bleibende Virusintegration zu gewährleisten und damit ein hohes Genexpressionslevel zu garantieren. Nun wird jenes gesuchte Faktor IX-Protein, welches für die Koagulationskaskade zur Gewährleistung einer korrekten Blutgerinnung wichtig ist, von zellulären Enzymen synthetisiert. Die Genotoxizität dieser Vektoren wurde sichtbar, als die gentherapeutisch behandelten Mäuse hepato-zelluläre Tumore in der Leber entwickelten. Das Virus bindet an molekulare Rezeptoren an der Oberfläche von Kupfferzellen in der Leber, wird dann in die Zelle aufgenommen und das virale RNA-Genom wird in dsDNA revers transkribiert. Diese dsDNA gelangt in den Nukleus und integriert in das Wirtszellgenom. In dieser Bachelorarbeit wurden die Vektor-Genom-Übergänge mit der LAM-PCR linear amplifiziert und dann mit dem nächsten Generation 454-Sequenzierer sequenziert. Die Daten wurden mit bioinformatischen Methoden, nach Reference Sequence Gene (RefSeqGene), ausgewertet, später nach retroviraler Integrationsstellen-Verteilung (RIS) und dann im Detail die Netzwerke jener Gene mit Ingenuity untersucht, die zur Entwicklung von Krebs führten. Erste statistische Untersuchungen zeigten, dass das Virus nicht zufällig integriert, sondern eine Präferenz für die ersten sieben murinen Chromosomen zeigt. Im Gegensatz zu den Resultaten der X-SCID Gentherapiestudie, wo das γ-Retrovirus verwendet wurde, welches die Transkriptions-Startseiten bevorzugt, zeigten EIAV-Vektoren eine Integrationspräferenz von 70-80% in Genen oder 10 Kilobasen vor- oder nachgelagert von aktiven Genen. Die Ingenuity Analyse präsentierte zuerst die gefunden toxischen Gene im Lebergewebe, die dann weiter im Detail untersucht wurden. Bei Netzwerkuntersuchungen des normalen Lebergewebes – das gilt für SMART2Z und SMARThFIX Vektor gleichermaßen - sind keine krebsinduzierenden Gene gefunden worden, nur TGF-α-Gen und MAPKA-8-Gen, die physiologisch das Leberwachstum beeinflussen. Wenn TNF-α überexprimiert wird, kann dieser zur Aktivitätssteigerung von TGF-α und MAPKA-8 führen, sodass es zu abnormem Zellwachstum kommen kann. Das Tumorgewebe des SMART2Z Vektors präsentiert einige Gene, die einen Einfluss auf das Protoonkogen TP53 aufweisen. Die Sequenzierung des SMART hFIX Vektors zeigt, dass das Protoonkogen cMyc direkt an den Vektor-Genom-Übergängen vorkommt, und so die Bildung von hepato-zellulären Tumoren begünstigt. Beiden Vektoren gemein ist das ADAME10-Gen, welches wiederum einen Einfluss auf die Gene ausübt, die Tumorwachstum induzieren. Dies belegt endgültig, dass das Wachstum des Lebergewebes zu hepatozellulären Tumoren in gentherapeutisch behandeltem Lebergewebe hauptsächlich auf Insertionsmutagenese beruht, die durch die Integration der EIAV Vektoren in das Wirtszellgenom in der Nähe von tumorinduzierenden Genen herbeigeführt wurde. Weitere Studien werden die Aktivität dieser gefundenen Gene untersuchen um ein abschließendes Bild der Genotoxizität dieser Vektoren zu erhalten und um zukünftig die Vektorsicherheit zu erhöht.


© Veterinärmedizinische Universität Wien Hilfe und Downloads