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Gewählte Publikation:

Publikationstyp: Master Thesis
Dokumenttyp:

Jahr: 2011

AutorInnen: Burger, S

Titel: “FineFIX“ and “PAXgene® tissue container” fixative solutions - a chance for improved morphology and higher RNA quality after laser capture micro dissection of tissue samples.

Quelle: Master Thesis, FH Campus Wien, pp. 104.

Autor/innen der Vetmeduni Vienna:

Burger Stefanie

Betreut von:
Walter Ingrid

Diese Publikation wurde nicht im Namen der Vetmeduni Vienna erstellt und ist deshalb ausschließlich der persönlichen Publikationsliste des/der Autors/Autorin zugeordnet!


Abstract:
Kryokonservierung ist derzeit der Goldstandard um Makromoleküle wie RNA, DNA und Proteine mit hoher Qualität aus Gewebeproben zu gewinnen. Jedoch hat Kryokonserverierung auch einige Nachteile, wie schlechter Morphologieerhalt und hohe Lagerungskosten. Gewebeproben, welche mit Formaldehyd fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet wurden, zeigen eine deutlich bessere Morphologie. Makromoleküle isoliert aus diesen fixierten Proben weisen jedoch eine viel schlechtere Qualität auf. Eine Anwendung bei der sowohl die Qualität der Makromoleküle als auch die Gewebemorphologie eine entscheidende Rolle spielt ist Laser Capture Mikrodissektion. Um die Einschränkungen durch die traditionellen Konservierungsmethoden zu überwinden, wurden alternative Fixiermittel entwickelt. Das Ziel dieser Studie war es vier verschiedene Konservierungsmethoden (“PAXgene® tissue container”, “FineFIX”, vier % Phosphat gepuffertem Formaldehyd anschließend eingebettet in Paraffin und Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff) zu vergleichen um die Hypothese zu überprüfen, dass Fixierung mit dem “PAXgene® tissue container” oder mit FineFIX” zu einer verbesserten Morphologie und einer besser RNA Qualität nach Laser Capture Mikrodissektion führt. Die Mikrodissektion wurde mittels Arcturus Veritas Laser Capture Microdissection System durchgeführt. Für die RNA Qualitätskontrolle wurde der Agilent Bioanalyser verwendet. Anschließend wurde zur Bestimmung der Eignung der gewonnenen RNA für qPCR Untersuchungen, qPCRs Analysen für die Referenzgenene OAZ1, GAPDH und HPRT1 durchgeführt. Die morphologische Qualität wurde mittels Bewertungsschema bestimmt. Kryokonservierte Proben zeigten die höchsten RIN Werte, gefolgt von Proben fixiert mit dem “PAXgene® tissue container”. Interessanterweise zeigten trotzdem Proben fixiert mit dem “PAXgene® tissue container” allgemein bessere qPCR Ergebnisse als kryokonservierte Proben, gefolgt von Proben fixiert mit “FineFIX”. Die schlechtesten qPCR Ergebnisse erzielten Formaldehyd fixierte Proben. Im Unterschied dazu zeigten Formaldehyd fixierte Proben die beste Morphologie, gefolgt von Proben fixiert mit dem “PAXgene® tissue container” oder mit “FineFIX”, wobei bei diesen der Morphologieerhalt stark organabhängig war. Bei kryokonservierten Proben war die beobachtete Morphologie größtenteils unzureichend. Entsprechend dieser Ergebnisse könnten Proben fixiert mit dem “PAXgene® tissue container” eine gute Alternative zu Gefrierproben in Genexpressions Studien nach Laser Capture Mikrodissektion darstellen. Weiters zeigt diese Studie, dass alle Präparationsschritte essentiell für das Gesamtergebnis eines Laser Capture Mikrodissektions Experiments sind. Besonderes Augenmerk sollte dabei auf die Auswahl der Gewebekonservierungsmethode gelegt werden, da nach erfolgter Fixierung diese nicht mehr Rückgängig gemacht werden kann. Weiters zeigt diese Studie, dass nur qPCR Ergebnisse von Proben mit der gleichen Fixierungsmethode verglichen werden sollten.


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