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Gewählte Publikation:

Publikationstyp: Dissertation
Dokumenttyp:

Jahr: 2011

AutorInnen: Troxler, Salome

Titel: Entwicklung einer real-time Reverse Transkription-PCR zur Diagnose von aviärem Hepatitis E Virus.

Titelvariante: Development of a real-time reverse transcription-PCR for detection of avian hepatitis E virus

Quelle: Dissertation, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 31.


Betreut von:

Hess Michael

Begutachtet von:
Weissenböck Herbert

Einrichtung:
Universitätsklinik für Geflügel und Fische, Klinische Abteilung für Geflügelmedizin


Abschluss Datum: 20.01.12


Abstract:
Aviäres Hepatitis E Virus, das ursächliche Agens der "Big-Liver-and-Spleen Disease" (BLSD) und des "Hepatitis-Splenomegaly Syndrome" (HSS), existiert weltweit in mindestens drei Genotypen, abhängig von der geografischen Herkunft der Isolate. Serologische Untersuchungen aus Großbritannien, Spanien und den USA weisen auf eine weite Verbreitung des RNA-Virus, auch in klinisch gesunden Herden, hin. Die genomische Organisation des aviären HEV entspricht jener des Säugetier-HEV, die gesamte Genomsequenz ist jedoch nur zu 50-60 % ident. Deshalb sind die molekulardiagnostischen Methoden für Säugetier-HEV nicht für aviäres HEV geeignet. Da die Vermehrung von aviärem HEV in Zellkultur nicht möglich ist, beschränkt sich die Diagnostik auf serologische Tests und Reverse Transkription-PCR (RT-PCR). Das Ziel dieser Arbeit war es daher, eine real-time RT-PCR Methode zu entwickeln, mit der alle aviären HEV Genotypen detektiert und quantifiziert werden können. Als Standard zur Quantifizierung und als heterologe interne Kontrolle wurde in-vitro transkribierte RNA verwendet, als Zielregion für die Primer und die degenerierte TaqMan-Sonde wurde der relativ konservierte ORF3 ausgesucht. Die neue real-time RT-PCR Methode hat eine über mehr als zehn Größenordnungen reichende Detektionsrate mit einer Effizienz von 1,04 und einem Determinationskoeffizienten von 0,996. Ein Minimum von 3,6 × 10^3 Kopien von aviärer HEV RNA pro Reaktion konnten zuverlässig gemessen werden. 16 klinische Proben von aviärem HEV, die alle Genotypen repräsentieren, wurden erfolgreich mit der real-time RT-PCR getestet. Im Unterschied dazu wurden mit der konventionellen RT-PCR Methode mit zwei unterschiedlichen Primerpaaren nur 13 beziehungsweise neun Proben detektiert. Beide Methoden hatten die gleiche Sensitivität. Die real-time RT-PCR ist spezifisch für aviäres HEV; positive Proben von Säugetier-HEV, aviärem Leukosevirus, Virus der Marekschen Krankheit, aviärem Reovirus, Geflügeladenovirus und eine Probe von RNA aus der Leber eines SPF Huhnes waren negativ. Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass die entwickelte TaqMan real-time RT-PCR zur schnellen und zuverlässigen Detektion von aviärem HEV in unterschiedlichem klinischen Probenmaterial geeignet ist. Weitere Vorteile der Methode sind die Möglichkeit der Quantifizierung der Virusmenge und der Inkludierung einer internen Positivkontrolle sowie die Detektion aller Genotypen mit einem einzigen Primerpaar.

Schlagworte:
Geflügel / Hepatitis E Virus / real-time RT-PCR / Interne Positivkontrolle


Im Rahmen der Hochschulschrift entstandene Publikation(en):

Troxler, S; Marek, A; Prokofieva, I; Bilic, I; Hess, M (2011): TaqMan real-time reverse transcription-PCR assay for universal detection and quantification of avian hepatitis E virus from clinical samples in the presence of a heterologous internal control RNA. J Clin Microbiol. 2011; 49(4):1339-1346
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