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Publikationstyp: Master Thesis
Dokumenttyp:

Jahr: 2012

AutorInnen: Wagner, Anja

Titel: The use of nano-LC-MALDI in identification of some selected proteins.

Titelvariante: Der Nutzen von nano-LC-MALDI zur Identifizierung einiger ausgewählter Proteine

Quelle: Master Thesis, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 74.


Betreut von:

Razzazi-Fazeli Ebrahim

Begutachtet von:
Gemeiner Manfred

Einrichtung:
VetCore


Abschluss Datum: 24.02.12


Abstract:
Nano-LC-MALDI ist eine oft verwendete Methode im Bereich Proteomics und hat in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Daher ist das Hauptziel dieser Masterarbeit die Etablierung einer nano-LC-MSMS Methode an der VetCore Facility der Veterinärmedizinischen Universität. Im ersten Teil der Studie werden Standardproteine wie Bovines Serum Albumin und Cytochrom C verwendet um das System zu etablieren und zu optimieren. Dafür werden die Proteine mit dem nano-HPLC-System getrennt und die Fraktionen mit einem Robotersystem (ProbotR) gesammelt. Mit Hilfe des ProbotsR können die Fraktionen direkt auf ein MALDI-Target gespottet werden. Einige Parameter von beiden Systemen müssen in die Überlegungen miteinbezogen und optimiert werden. Dazu zählen zum Beispiel das Zeitintervall, die Spotrichtung und ein optimales Alignment des Targets. Zusätzlich kann auch Matrix mit dem ProbotR-System gespottet werden. Die aufgetrennten Peptide werden anschließend mittels MALDI-TOF/TOF analysiert. Nach der Etablierung der Methode soll diese angewendet werden, um Pilzproteine zu identifizieren. Dafür werden die Pilzproteine extrahiert und mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Zur Visualisierung wird eine Silberfärbung durchgeführt. Einige Banden werden ausgeschnitten und entfärbt. Nach einer Reduzierung und Alkylierung folgt ein in-Gel-Verdau mit Trypsin. Danach werden die Peptide extrahiert und eine ZipTip-Aufreinigung durchgeführt. 0,5 μl der Probe werden direkt auf ein MALDI-Target gespottet und der Rest wird mittels nano-LC-MALDI analysiert um beide Methoden zu vergleichen. Die prozessierten Spektren werden mit Hilfe von Mascot gegen die NCBI-Datenbank gesucht. Die Ergebnisse werden in Hinsicht auf die Anzahl der MSMS-Spektren, der Proteinidentifizierung, der Scores und der Anzahl der zu den identifizierten Proteinen passenden Peptide analysiert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass nano-LC-MALDI der traditionellen MALDI-Analyse überlegen ist. Durch die Fraktionierung mittels nano-LC vor der MALDI-Analyse wird die Komplexität der Proben reduziert, was in weiterer Folge die Unterdrückung von Ionen reduziert. Aus diesem Grund können mehr Peptide analysiert werden. Dies wiederum erhöht die Anzahl der erhaltenen MSMS-Spektren und die Anzahl der zu identifizierten Proteinen passenden Peptide. Dadurch wird auch der Score erhöht, weil die Wahrscheinlichkeit, dass eine Identifizierung zufällig entsteht, reduziert wird. Insgesamt können auch mehr Proteine mit nano-LC-MALDI als mit MALDI identifiziert werden.


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