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Publikationstyp: Master Thesis
Dokumenttyp:

Jahr: 2012

AutorInnen: Stadlmann, Valerie

Titel: Establishment of a novel system for the quantitative determination of diamine oxidase.

Titelvariante: Entwicklung eines neuen Systems für die quantitative Bestimmung von Diaminoxidase

Quelle: Master Thesis, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 70.


Betreut von:

Razzazi-Fazeli Ebrahim

Begutachtet von:
Staniek Katrin

Einrichtung:
VetCore


Abschluss Datum: 26.09.12


Abstract:
Ziel dieser Masterarbeit war die Entwicklung eines neuen quantitativen Tests für die Bestimmung von Diaminooxidase (DAO) in biologischen Flüssigkeiten. DAO ist ein kupferhältiges, sekretiertes Enzym, das eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der biogenen Amine (zB. Histamin) spielt. Ein Ungleichgewicht der Menge an aufgenommenen biogenen Aminen und der DAO Konzentration oder Aktivität führt zu den klinischen Symptomen der Histamin Intoleranz (HIT). Die derzeitige HIT Diagnose basiert unter anderem auf der Messung der DAO Aktivität im Serum. Die DAO Aktivitätsmessung zeigt eine eher geringe Korrelation zu dem klinischen Bild der HIT. Daher wird ein quantitativer Test benötigt, der die tatsächliche Menge an DAO misst, unabhängig von ihrer Aktivität. Ein quantitativer Assay zeigt idealerweise eine bessere Korrelation zur Klinik und hat das Potential, die Diagnostik zu erleichtern. In dieser Studie wurde DAO aus humaner Plazenta isoliert und mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation, Hydrophober Interaktionschromatographie (HIC) und Cellufine Sulfat Affinitätschromatographie (CS) aufgereinigt. Die Aufreinigung des Ezyms wurde mittels BCA Proteinbestimmung, Radio Extraktionsassay (DAO-REA®) und SDSPAGE des Enzyms evaluiert. Affinitätsgereinigte DAO wurde für die Immunisierung von Kaninchen herangezogen. Die IgG-Fraktion der Kaninchenseren wurde via Protein A aufgereinigt. Mit Hilfe der aufgereinigten Antikörper wurden zwei ELISA-Tests entwickelt. In einem kompetitiven ELISA wurde CS-gereinigte DAO als Probe eingesetzt. Unter optimierten Bedingungen wurde ein HEPES Puffer mit Guanidinhydrochlorid eingesetzt und die Inkubationsbedingungen des Primär-Kaninchenantikörpers auf 37°C für 3 h eingestellt. In einem weiteren Schritt wurde ein Sandwich ELISA getestet: ELISA Platten wurden mit 70 ng/Well Kaninchen anti-DAO IgG beschichtet. HIC-DAO wurde als Probe eingesetzt und mit biotinyliertem Kaninchen anti-DAOIgG detektiert. Unter optimierten Bedingungen war im Sandwich ELISA eine Verdünnungskurve von 0.6-5 μg/ml Gesamtproteingehalt einer HIC-Fraktion messbar, Kaninchen-anti-DAO-IgG wurde 1:3.000 in HEPES Puffer mit Guanidinhydrochlorid verdünnt. Streptavidin-Meerrettichperoxidase wurde in einer 1:30.000 Verdünnung in kommerziell erhältlichem Konjugat Stabilisator eingesetzt. 1% Polyethylenglycol 6000 erwies sich als geeignetes Blockierungsmittel für diesen Testansatz. Die entwickelten ELISA Systeme wurden keiner Validierung unterzogen. Im Zuge der Testentwicklung wurde aufgereinigte human-DAO anstatt nativer, physiologischer Proben eingesetzt.


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