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Gewählte Publikation:

Publikationstyp: Master Thesis
Dokumenttyp:

Jahr: 2014

AutorInnen: Hochreiter, Bernhard

Titel: Studies on the composition and interaction of inflammatory signaling molecules with a focus on high-end microscopy.

Titelvariante: Studien zur Zusammensetzung und Interaktion von Signalmolekülen entzündlicher Prozesse mit einem Fokus auf High-end Mikroskopie

Quelle: Master Thesis, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 82.


Betreut von:

Pohl Elena

Begutachtet von:
Egerbacher Monika

Einrichtung:
Institut für Physiologie, Pathophysiologie und Biophysik, Abteilung für Physiologie und Biophysik


Abschluss Datum: 30.04.15


Abstract:
Der NF-κB Signalweg ist einer der wichtigsten Signalwege während der Immunantwort auf die verschiedensten Reize. Ebenso wurden Verbindungen zu vielen anderen Signalwegen bereits bewiesen. Ein Teil des NF-κB Signalweges ist der IKK Komplex, bestehend aus den drei Untereinheiten IKKα, IKKβund NEMO. Viele FunktionendieserUntereinheiten abseits von NF-κB wurden bereits erforscht, und Verbindungen zu vielen biologischen Funktionen konnten hergestellt werden. Obwohl diese Interaktionen gut untersucht sind, ist vieles über den IKK komplex noch unbekannt, einschließlich seines strukturellen Aufbaus und der Reaktionsdynamik. Ein Hauptteil dieser Arbeit soll Einblick bieten in die komplexe Dynamik des IKK komplexes nach der Aktivierung des Signalweges durch TNFα.Zuallererst wurde versucht, fluoreszierend markierte IKK Untereinheiten in natürlichen Konzentrationslevels zu erreichen, indem die Methode der RNA-Interferenz mit einem Überexpressionsmodell kombiniert wurde. Die Methode konnte zwar nicht wie geplant auf einen einzelnen Vektor reduziert werden, es wurde aber gezeigt dass RNAi und Überexpression perfekt zusammenarbeiten können ohne miteinander zu interferieren. Die Bestimmung der Dynamik des IKK Komplexes wurde durch das Beobachten des FRET-Signals zwischen fluoreszenzmarkierten Untereinheiten des IKK Komplexes erreicht. Es wurde klar gezeigt, dass alle Untereinheiten eine gewisse Dissoziation zeigen. Dies wurde auch mit der Komplementärmethode der Co-Immunoprezipitation von IKKβ mit IKKα gezeigt. Ein anderer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Verbesserung der 3-Filter FRET Methode. Es wurden unterschiedliche Transfektions-Ratios verwendet und durch das verwenden eines Konstruktes mit einem fixen 1zu1 Ratio normalisiert. Dadurch wurde eine Titrationskurve erstellt mit der es möglich war, Werte wie die Proteinaffinität Ka, das Verhältnis bei Sättigung des Donors rsat und den maximal erreichbaren FRET wert zu bestimmen. Zusätzlich enthielt die Arbeit erste Experimente einer neuen Methode namens FRET-FRAP, bei der die Methoden FRET und FRAP kombiniert wurden um die Dissoziation von Proteinen zu bestimmen. Dabei können aus der Kurve der Erholung der Fluoreszenz nach einer Bleichung möglicherweise wichtige Informationen extrahiert werden.


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