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Gewählte Publikation:

Publikationstyp: Master Thesis
Dokumenttyp:

Jahr: 2015

AutorInnen: Kössler, Elisabeth

Titel: Evaluation of three colorimetric Protein assays for proteomic purposes.

Titelvariante: Die Evaluierung von 3 kolorimetrischen Proteinverfahren welche im Bereich Proteomics eingesetzt werden

Quelle: Master Thesis, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 100.


Betreut von:

Razzazi-Fazeli Ebrahim

Begutachtet von:
Duvigneau Catharina

Einrichtung:
VetCore


Abschluss Datum: 18.12.15


Abstract:
In der Forschung als auch im klinischen Labor ist die exakte Bestimmung der Proteinkonzentration eine wichtige Voraussetzung. Bevor mit der Proteinanalyse begonnen wird, muss die Menge an Protein bestimmt werden. Sehr viele unterschiedliche Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration mit ihren Vorund Nachteilen stehen zur Verfügung. Deshalb ist die Auswahl der angemessenen Methode, welche die Konzentration exakt und reproduzierbar bestimmen kann, sehr wichtig. Diese Studie beschäftigt sich mit drei Proteinfärbemethoden, das Bradford, Pierce 660 nm und BCA Verfahren, welche mit einem neuartigen Spektralphotometer, genannt NanoDrop, getestet und miteinander verglichen werden. Zusätzlich wird noch der Einfluss von drei unterschiedlichen Lysis Puffern untersucht. Diese Puffer werden vor allem im Proteomicsbereich für die Proteinextraktion mit anschließender 1-D oder 2-D Gelelektrophorese eingesetzt. Zu dem Spektralphotometer wird noch eine zweite, häufig genützte Methode, die Mikrotiterplatten, eingesetzt, um die Anwendbarkeit des NanoDrops zu überprüfen und zu vergleichen. Alle Proteinfärbemethoden werden anhand der intra-day und inter-day Wiederholbarkeit, mit ihrer Richtigkeit, validiert. Fünf Standards und drei unabhängig hergestellte Standards, sowie 2 Referenzmaterialen basierend auf Humanserum (PreciNorm und PreciPath) werden für die Validation verwendet. Die Referenzproben benötigt man für die Kontrolle der Richtigkeit und Präzision der Ergebnisse und sie sind deshalb für den Validierungsprozess essentiell. Um die Anwendbarkeit der Färbemethoden zu testen, werden zwei Realproben, bestehend aus extrahierten Proteinen aus Penicillium verrucosum, eingesetzt. Mittelwert, Standardabweichung, sowie Variationskoeffizient von jedem Standard und von beiden Referenzproben werden für die Validierung der Methoden bestimmt. Die intra-day Wiederholbarkeit beinhaltet drei unabhängige Messungen der Standards und Proben innerhalb eines Tages. Die inter-day Wiederholbarkeit wurde auf drei aufeinanderfolgenden Tagen gemessen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Bradford Verfahren in Kombination mit den Mikrotiterplatten die besten und genauesten Ergebnisse bei der Richtigkeit, so wie die geringsten Abweichungen und Variationen der Messungen liefert. Das Bradford Verfahren kombiniert mit dem NanoDrop war für die Messungen nicht geeignet, da es zu unsicheren und instabilen Ergebnissen führte. Das Pierce 660 nm Verfahren konnte man jedoch für beide Methoden anwenden, da kein Unterschied zwischen der Trueness oder den gemessenen Ergebnissen zu beobachten war. Das BCA Verfahren funktionierte bei beiden Methoden, jedoch konnte nur PBS und Lysis Puffer 3 gemessen werden, da Lysis Puffer 1 und 2 inkompatibel mit dem BCA Assay war.


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