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Gewählte Publikation:

Publikationstyp: Dissertation

Publikationsjahr: 2016

AutorInnen: Stadler, Julia Anna

Titel: DNA mutations in cancer: a personalised approach to assess tumor dynamics in melanoma patients.

Titelvariante: DNA-Mutationen in Tumoren: ein personalisierter Ansatz zur Messung der Tumordynamik bei Melanom-Patienten

Quelle: Dissertation, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 68.


Betreut von:

Brem Gottfried

Begutachtet von:
Klein Dieter

Einrichtung:
Institut für Tierzucht und Genetik


Abstract:
Da bei Krebspatienten zirkulierende zell-freie Tumor-DNA nur in geringen Mengen im Blut vorkommt, stellt die präzise Detektion eine technische Herausforderung dar. Zur Analyse von zell-freier Tumor-DNA werden einige verschiedene Untersuchungsmethoden angewandt, allerdings gibt es derzeit keinen wissenschaftlichen Goldstandard. Um die Anforderungen hinsichtlich einer hohen analytischen Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten, wurde ein neuartiges ARMS (amplification refractory mutation system) real-time qPCR Protokoll etabliert. Für die entwickelte ARMS qPCR Methode wurden 3 ARMS Assays zur Detektion der Punktmutationen BRAF V600E, PTEN T167A und NRAS Q61L designed. Für die durchgeführten Spike-in-Experimente wurde Tumor-DNA aus Melanom-Zelllinien isoliert und seriell verdünnt. Dabei wurde die Tumor-DNA soweit verdünnt, dass pro qPCR Reaktion in einem hohen Hintergrund von Wildtypsequenzen theoretisch nur ein Tumor-Molekül vorhanden ist. Das Detektionslimit der Methode wurde verbessert, indem eine spezielle Polymerase (SNPase) eingesetzt wurde, die für den Nachweis von Punktmutationen entwickelt wurde. Die Methode wird daher „SNPase-ARMS qPCR“ genannt. Anhand der BRAF V600E und PTEN T167A Assays konnte eine extrem hohe Sensitivität erzielt werden, da eine Tumorkopie in 200 000 wild-typ Kopien präzise detektiert werden konnte. Der NRAS Q61L Assay konnte drei Tumorkopien in einem Hintergrund von 200 000 wild-typ Kopien detektieren. Um die klinische Anwendungsmöglichkeit dieser Methode zu untersuchen, wurde der BRAF V600E Assay auch an neun BRAF V600E positiver Melanompatienten getestet. Während Melanompatienten ohne Metastasen negativ auf BRAF V600E waren, konnten bei Melanompatienten mit fortgeschrittenem Krankheitsstadium höhere BRAF V600E Konzentrationen im Plasma gemessen werden.


Im Rahmen der Hochschulschrift entstandene Publikation(en):

Stadler, J; Eder, J; Pratscher, B; Brandt, S; Schneller, D; Müllegger, R; Vogl, C; Trautinger, F; Brem, G; Burgstaller, JP (2015): SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation-Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015; 10(11):e0142273
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