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Publikationstyp: Dissertation
Dokumenttyp:

Jahr: 2010

AutorInnen: Velde, Karsten

Titel: Viral vector mediated neuroanatomical track tracing.

Titelvariante: Virale Vektoren für neuroanatomische Studien

Quelle: Dissertation, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 95.


Autor/innen der Vetmeduni Vienna:

Velde Karsten

Betreut von:
Renner Matthias

Begutachtet von:
Egerbacher Monika

Einrichtung:
Institut für Virologie


Abschluss Datum: 08.03.2010


Abstract:
Die Hemiplegia laryngis des Pferdes ist eine neurodegenerative Erkrankung mit erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung. Die Pathologie ist beschrieben als distale Axonopathie des N. laryngeus recurrens, während die Ätiologie ungeklärt ist. Ebenso ist die genaue Anatomie des erkrankten Nervs unbekannt, da sich der Rekurrens zu über 50% seiner Länge im zervikalen N. vagus befinden. Die genaue Organisation der Rekurrenzfasern und deren präzise anatomische Lokalisation sind nicht beschrieben, sodass die proximale Ausbreitung der progressiv fortschreitenden Axonopathie nicht untersucht werden kann. In dieser Arbeit wurde, um Axone langer peripherer Nerven genetisch markieren zu können, ein Markergen unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus (CMV) Enhancer/ Hühner [beta]-Aktin (CBA) Promoters, der hohe Expressionslevel in Nervenzellen erlauben sollte, in einen replikations-defizienten Adeno-Assoziierten viralen Vektor (AAV) inseriert. Als Transgen wurde das bovine Tau-Gen fusioniert mit dem Markergen für das grün fluoreszierende Protein (eGFP) verwendet. Tau gehört zur Familie der Mikotubulus-assoziierten (MAP) Proteine und wird als solches gerichtet in die Axone transportiert und ins Axonskelett eingebaut. In in vitro Infektionsanalysen konnte die Funktionalität dieser Vektoren durch erfolgreiche Transduktion von neuronalen Zelllinien gezeigt werden. Für in vivo Experimente wurden zunächst kommerziell erhältliche rAAV Vektoren, die das eGFP-Markergen tragen und mit Capsidproteinen unterschiedlicher AAV-Serotypen ausgestattet sind (rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, rAAV2/7, rAAV2/8, rAAV2/9CBA2, rAAV2/9CBA1, rAAV2/9CMV and rAAVrh10), eingesetzt. Zusätzlich wurden 2 pseudotypisierte lentivirale Vektoren, die mit den Oberflächenantigenen des Vesikulären Stomatitisvirus und des Rabiesvirus pseudotypisiert waren (VSV-G-HIV1-eGFP, Rabies-G-HIV1-eGFP) produziert. Sämtliche Vektoren wurden zunächst auf ihre Funktionalität durch Transduktion verschiedener, inklusive neuronaler Zelllinien in Zellkulturen getestet. Die direkte Injektion der Vektoren ins Gehirn von Ratten führte nur bei den Vektoren rAAV2/1, rAAV2/9CBA2, rAAV2/9CBA1, rAAV2/9CMV und VSV-G-HIV1-eGFP zu Transduktion von und Transgenexpression in neuronalen Zellen. eGFP-exprimierende Neurone wurden auch weiter entfernt von der Injektionsstelle gefunden, was einen axonalen Transport der Vektoren vermuten läßt. Daraufhin wurden beide lentiviralen Vektoren und eine Auswahl an rAAV Vektoren in die zwei Hauptäste des N. ischiaticus (N. tibialis und N. peroneus communis) bzw. in den M. gastrocnemius oder die Zehenstreckmuskulatur (Zehenstrecker) der Hintergliedmaße der Ratten injiziert. Bei nur einem Tier konnten 2 GFP positive Neurone im Lumbalmark nach Injektion von VSV-G-HIV1-eGFP in den N. tibialis gefunden werden. Alle anderen Vektoren führten nicht zur detektierbaren Infektion von Rückenmarksneuronen nach Applikation in der Peripherie. Mittels quantitativer Real Time-PCR konnte bei 2 Tieren, die rAAV2/2-Injektionen in den N. ischiaticus erhalten hatten, virale DNA (GFP) im Rückenmark nachgewiesen werden. Damit konnte gezeigt werden, dass rAAV-Vektoren retrograd axonal transportiert werden, auch wenn dies nicht oder in einem zu geringen Ausmaß zur Expression des Markergenes führte. Durch die rasante Weiterentwicklung der viralen Vektortechnologie und dem Design effizienterer Vektoren wie z.B. von scAAV Vektoren, die bereits einen komplementären zweiten DNA-Strang besitzen, sollte in Zukunft die erfolgreiche Infektion von Rückenmarksneuronen nach Applikation der Vektoren in periphere Nerven zielführend sein.

Schlagworte:
virale Vektoren / faszikuläre Anatomie / rAAV / Lentiviren


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