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Gewählte Publikation:

Publikationstyp: Dissertation
Dokumenttyp:

Jahr: 2013

AutorInnen: Dzieciol, Monika

Titel: Optimization of real-time PCR for detection and expression studies of fastidious microorganisms.

Titelvariante: Die Optimierung der real-time PCR für den Nachweis von und für Expressionsstudien an anspruchsvollen Mikroorganismen

Quelle: Dissertation, Vet. Med. Univ. Wien, pp. 98.


Autor/innen der Vetmeduni Vienna:

Dzieciol Monika

Betreut von:
Wagner Martin

Einrichtung:
Institut für Lebensmittelsicherheit, Lebensmitteltechnologie und öffentliches Gesundheitswesen in der Veterinärmedizin, Abteilung für Lebensmittelmikrobiologie


Abschluss Datum: 04.03.13


Abstract:
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde 1983 von Mullis erfunden und diente als Grundlage für die Entwicklung der real-time PCR (qPCR). Das Detektieren und Quantifizierenvon spezifischen Genen in Echtzeit revolutionierte die Molekularbiologie sowie das Gesundheitswesen. Es wurde gezeigt, dass es sich hierbei um eine schnelle und sensitive Technologie für die diagnostische Identifikation von Erregern in Lebensmitteln handelt. Um eine effiziente qPCR oder eine quantitative Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) zu entwickeln, bedarf es einer ausführlichen Evaluierung der PCR Parameter. Die Entwicklung verlangt strategisches Planen und eine Vielzahl von Testversuchen, um die optimalen Reaktionsbedingungen zu finden. Dazu gehört das Design von spezifischen Zielsequenzen, Primern und der Sonde. Außerdem folgen die Optimierung der Amplifikationsbedingungen und -reaktionen, die Evaluation von Inklusivität und Exklusivität, die Bestimmung der qualitativen und quantitativen Nachweisgrenze der ausgewählten Zielsequenzen sowie die Anwendung auf künstlich und natürlich kontaminierte Proben. Die verschiedenen Optimierungen der molekularen Systeme zur Untersuchung von bakteriellen Pathogenen, die in dieser Studie präsentiert werden, bieten einen praktischen Zugang zur Lösung von typischen Problemen, die bei der qPCR und bei Expressionsstudien auftreten. Die Applikation der qPCR verspricht eine niedrige Nachweisgrenze und ermöglicht den quantitativen Nachweis von bakteriellen Pathogenen in Lebensmitteln. Für eine weitere Verbesserung der Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) Nachweisgrenze und Quantifizierung wurde die MAP-spezifische Mptb52.16 Zielsequenz ausgewählt und erfolgreich in Milch angewandt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Konzentrierung von DNA aus einem größeren Probevolumina verbunden mit einem qPCR-System eine Quantifizierung niedriger Level von MAP-Zellen in Rohmilch ermöglicht. Eine neu konstruierte und optimierte RT-PCR Methode wurde erfolgreich in einer Studie über den Einfluss von Gallensalzen auf die Multidrug CmeABC Efflux Pumpe und Cj0561c Gentranskription im Lebensmittelpathogen Campylobacter jejuni beschrieben. Für die Quantifizierung und die Differenzierung von emetischen und nicht-emetischen Bacilluscereus Stämmen wurde eine diagnostische qPCR erfolgreich hergestellt und an Milchprodukten evaluiert. Dieser Assay hat einen großen diagnostischen Vorteil, da erstmals die gleichzeitige Quantifizierung und Differenzierung der B. cereus sensu lato und des emetischen B. cereus ermöglicht wird. Zusätzlich können sämtliche B. cereus Stämme in Milchprodukten quantifiziert werden.Optimierte qPCR und RT-PCR-Assays erlauben eine schnellere Analyse als vergleichbare Methoden wie Ausplattierungen auf Nährmedien und können für die Identifizierung von bakteriellen Pathogenen in Lebensmitteln eingesetzt werden.


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